Cuantificación de la expresión del gen amo-A en poblaciones bacterianas y archaeales presentes en muestras de suelos de un lote arrocero caracterizado por ambientes

El ciclo del nitrógeno representa uno de los procesos biogeoquímicos más importantes para los ecosistemas terrestres y acuáticos. Las comunidades microbianas desempeñan un papel crucial en los procesos de transformación del nitrógeno en el suelo, ya que participan en diversas etapas como la nitrificación, de gran importancia para la producción agrícola. Dentro de los marcadores moleculares más utilizados para evaluar la actividad de poblaciones microbianas oxidantes de amonio se han considerado ampliamente los genes que codifican enzimas claves como la subunidad A de la actividad amonio monooxigenasa (AMO). Sin embargo, no se comprende completamente si la expresión de esta enzima tiene relación directa con el rendimiento de los cultivos. En este contexto, se evaluó la expresión del gen amo-A de comunidades bacterianas y archaeales presentes en un lote arrocero previamente caracterizado por ambientes. Para cuantificar la abundancia de arqueas y bacterias oxidantes de amonio, (AOA y AOB, respectivamente) se emplearon las técnicas de PCR en tiempo real (RT-qPCR) y PCR digital (RT-dPCR). En este trabajo se encontró a través del análisis de datos metagenómicos que hubo una mayor presencia de AOB en las muestras de suelo rizosférico mientras que las AOA fueron predominantes en las muestras de suelo de soporte "bulk", sin embargo, no se detectó la expresión del gen amo-A asociada a la comunidad de bacterias en las muestras de suelo analizadas. Por otra parte, no se presentaron diferencias entre los transcritos del gen amo-A asociados a la comunidad de AOA de los ambientes caracterizados. Además, la expresión de transcritos no estuvo relacionada con alguna de las propiedades químicas evaluadas. Finalmente, las estrategias de cuantificación para RT-qPCR (plásmido y templete) resultaron ser homólogas y funcionales para identificar la expresión del gen amo-A de AOA, mientras que la técnica de RT-dPCR fue más precisa para el análisis de la comunidad de AOB y AOA.

The nitrogen cycle represents one the most important biogeochemical process for terrestrial and aquatic ecosystems. Microbial communities play a crucial role in the processes of transformation of soil nitrogen in the, since they participate in various stages such as nitrification, which is of great importance for agricultural production. Among the most used molecular markers to assess ammonium oxidizing microbial populations activity have been considered widely the genes encoding key enzymes such as ammonium monooxygenase (AMO) subunit A. However, it is not fully understood whether the expression of this enzyme is directly related to the crop yield. In this context, this research work evaluated the expression of the amo-A gene of bacterial and archaeal communities present in a rice field previously characterized by environments. Real-time PCR (RT-qPCR) and digital PCR (RT-dPCR) techniques were used to quantify the abundance of archaea and ammonium-oxidizing bacteria (AOA and AOB, respectively). In this work it was found that in the analysis of metagenomic data there was a greater presence of AOB in rhizospheric soil samples while AOA were predominant in bulk soil samples, however, the expression of the amo-A gene was not detected. associated with the community of bacteria in the soil samples analyzed. On the other hand, it was found that the transcripts of the amo-A gene of the AOA community did not present differences between the characterized environments. Furthermore, the expression of transcripts is not related to any of the chemical properties evaluated. Finally, the quantification strategies for RT-qPCR (plasmid and quenching) turned out to be homologous and functional to identify the expression of the AOA amo-A gene, while the RT-dPCR technique was more precise for the analysis of the community of AOB and AOA.

SFRP1, Posible biomarcador en la progresión o regresión de lesiones de cérvix asociado al Virus del Papiloma Humano / SFRP1, Possible Biomarker in the Progression or Regression of Cervical Pre-neoplastic Lesions Associated with Human Papilloma Virus

Resumen Objetivo: Comparar la expresión de mRNA y proteínas de SFRP1, PTPRN, CDO1, EDNRB, CDX2, EPB41L3 y HAND1 en pacientes con lesión intra-epitelial cervical de bajo y alto grado, con posterior progresión o regresión. Material y Método: Se realizó análisis de expresión de genes mediante RT-PCR y análisis de expresión de proteínas por inmunohistoquímica. El análisis estadís tico fue realizado con las pruebas: Wilcoxon, coeficiente de correlación de Spearman e índice de concordancia. Las muestras fueron pareadas en momento 1 y momento 2. Resultados: SFRP1 mostró tendencia de mayor expresión de mRNA en lesión intra-epitelial de bajo grado (momento 2) Vs. alto grado (momento 1). La expresión de proteínas por inmunohistoquímica de SFRP1 en casos de progresión (83,3 %) mostró disminución en su graduación (p = 0,0313*); los demás genes en estudio no tuvieron cambios estadísticamente significativos. Discusión: SFRP1 mostró comportamiento ajustado a resultados de estudios previos donde se encontró hipermetilado en lesiones intra-epiteliales de alto grado; su subexpresión por hipermetilación se reportó en otros canceres, proceso que colabora con su silenciamiento y transición epitelial-mesenquimatosa del cáncer de cuello uterino. Conclusiones. SFRP1 es potencial biomarcador en lesiones preneoplásicas del cuello uterino asociadas al virus de papiloma humano.

Abstract Objective. The aim of this work was to compare the expression of mRNA and proteins of SFRP1, PTPRN, CDO1, EDNRB, CDX2, EPB41L3 and HAND1 in patients with low and high grade cervical intraepithelial lesion, with subsequent progression or regression. Material and Methods: Gene expression analysis was conducted through RT-PCR and protein expression analysis was performed by immunohistochemistry. The statistics analysis were Wilcoxon test, Spearman's correlation coefficient and concordance index. The samples were paired during moment 1 (initial patient diag nosis) and moment 2 (follow-up histological diagnosis). Results: SFRP1 showed a trend of higher mRNA expression in low-grade intra-epithelial lesions (moment 2) Vs. high-grade (moment 1). The expression of proteins by immunohistochemistry of SFRP1 in progression cases (83.3%) showed a decrease in its graduation (p = 0.0313*); the other genes under study had no statistically significant. Discussion: SFRP1 showed a biological behavior adjusted to the results of previous studies where hypermethylation was found in high-grade intra-epithelial lesions; its subexpression by hypermethylation has been reported in other cancers, a process that collaborates with its silencing and epithelial-mesenchymal tran sition of cervical. Conclusions. SFRP1 is a potential biomarker in preneoplastic lesions of the cervix associated with human papillomavirus.

Método LAMP como alternativa diagnostica para la detección del virus SARS-CoV-2 / LAMP method as a diagnostic alternative for the detection of the SARS-CoV-2 virus / Método LAMP como alternativa de diagnóstico para a detecção do vírus SARS-CoV-2

RESUMEN Introducción: el coronavirus SARS-CoV-2, causante de la enfermedad COVID-19 se ha convertido en un problema de salud pública mundial que requiere la implemen-tación de pruebas de diagnóstico rápidas y sensibles. Objetivo: evaluar y comparar el límite de detección del método LAMP con respecto al método estándar y aplicar el método RT-LAMP para el diagnóstico de SARS-CoV-2 en muestras clínicas de pacientes colombianos. Métodos: se realizó un estudio descriptivo y transversal, analizando un total de 25 muestras de hisopado nasofaríngeo incluyendo muestras negativas y positivas para SARS-CoV-2, a través del método RT-LAMP comparado con el método estándar RT-qPCR. Resultados: el método LAMP detectó ~18 copias del gen N, en 30 min, demostrando un límite de detección similar al obtenido con el método estándar, en un menor tiempo y una concordancia en RT-LAMP del 100 % con los resultados. Conclusiones: RT-LAMP es un método sensible, específico y rápido que puede ser empleado para el diagnóstico de la enfermedad COVID-19.

SUMMARY Introduction: The SARS-CoV-2 coronavirus, that causes the COVID-19 disease, has become a global public health problem that requires the implementation of rapid and sensitive diagnostic tests. Aim: To evaluate and compare the sensitivity of LAMP assay to a standard method and use RT-LAMP for the diagnosis of SARS-CoV-2 in clinical samples from Colombian patients. Methods: A descriptive and cross-sectional study was conducted. A total of 25 nasopharyngeal swab samples including negative and positive samples for SARS-CoV-2 were analyzed, through the RT-LAMP method compared to the RT-qPCR assay. Results: LAMP method detected ~18 copies of the N gene, in 30 min, evidenced a detection limit similar to the standard method, in a shorter time and a concordance in RT-LAMP of 100% with the results. Conclusions: RT-LAMP is a sensitive, specific, and rapid method that can be used as a diagnostic aid of COVID-19 disease.

RESUMO Introdução: o coronavírus SARS-CoV-2, causador da doença de COVID-19, tornou-se um problema de saúde pública global que requer a implementação de testes diagnósticos rápidos e sensíveis. Objetivo: avaliar e comparar o limite de detecção do método LAMP em relação ao método padrão e aplicar o método RT-LAMP para o diagnóstico de SARS-CoV-2 em amostras clínicas de pacientes colombianos. Métodos: foi realizado um estudo descritivo e transversal, analisando um total de 25 amostras de hissopado nasofaríngeo, incluindo amostras negativas e positivas para SARS-CoV-2, pelo método RT-LAMP em comparação ao método RT-qPCR padrão. Resultados: o método LAMP detectou ~18 cópias do gene N, em 30 min., demonstrando um limite de detecção semelhante ao obtido com o método padrão, em um tempo menor e uma concordância no RT-LAMP de 100% com os resultados. Conclusões: RT-LAMP é um método sensível, específico e rápido que pode ser usado para o diagnóstico da doença de COVID-19.

Señuelo dirigido a HIF-1 potencializa efectos citotóxicos de dos agentes quimioterapéuticos en MDA-MB-231 / HIF decoy improve cytotoxic effects of two chemotherapeutic agents on MDA-MB-231

RESUMEN Procesos oncogénicos como proliferación incontrolable, resistencia apoptótica, aumento de mecanismos angiogénicos y evasión inmune son regulados generalmente por factores de transcripción, como HIF-1. Por tanto, se ha señalado a esta molécula como un blanco terapéutico prometedor. Para explorar esta posibilidad, un oligonucleótido tipo "señuelo" dirigido a HIF-1 a (ODN) fue diseñado para evaluar su eficiencia en esquema tanto monoterapéutico, como en combinación con dos agentes quimioterapéuticos en un modelo in vitro de cáncer de mama. Después de comprobar, mediante citometría de flujo e inmunofluorescencia, la localización del blanco, el señuelo fue transfectado en la línea celular MDA-MB-231. Se estableció la IC-50 de HIF-1 a ODN, Cisplatino y Taxol con el método de Resazurina. Mecanismos de muerte celular fueron evaluados con el método de TUNEL. Por último, se estableció el índice de combinación (IC) de cada uno de los quimio-agentes en combinación con el ODN. Se evidencio que HIF-1 a ODN causa un efecto citotóxico en MDA-MB-231 de hasta un 90% hacia las 72h pos-tratamiento. Este efecto no se observa tanto en los controles del ensayo, como en el cultivo primario de células no tumorales (FIBRO), siendo este agente altamente selectivo hacia células tumorales, al activar mecanismos pro-apoptóticos. A su vez, HIF-1 a ODN potencializa la actividad tumorogénica de Cisplatino y Taxol en la línea celular tumoral. Por tanto, HIF-1 a ODN demostró tener actividad selectiva potencialmente antitumoral, al disminuir la proliferación celular e inducir apoptosis; optimizando de forma sinérgica, la eficacia de fármacos quimioterapéuticos de alto espectro, en tratamientos combinados.

ABSTRACT Oncogenic processes like uncontrollable proliferation, resistance to apoptosis, increases in angiogenic mechanisms and immune evasion are regulated by transcription factors such HIF-1. Therefore, this molecule is regarded as a potential therapeutic target. To explore this possibility, a HIF-1 α oligonucleotide decoy (ODN) was designed to evaluate its efficiency on both a mono-therapeutic scheme and a mixed treatment with two chemotherapeutic agents within an in vitro model of breast cancer. After confirming the target location with flow cytometry and immunofluorescence assays, that decoy was transfected over the MDA-MB-231 cell line. We established the HIF-1 α ODN, Cisplatin and Taxol IC-50 using Resazurin tests. Cell death mechanisms was evaluated with TUNEL. Finally, we obtained the combination index (IC) of each chemical agents with the ODN. This study showed that HIF-1 α ODN caused a cytotoxic effect (up to 90%) in MDA-MB-231 during 72 hours post treatment. That effect did not appear in either the assay controls nor in non-tumor cell cultures (FIBRO). This agent is highly selective towards tumor cells, activating pro-apoptotic mechanisms. Additionally, HIF-1 α ODN increases the tumorigenic action of Cisplatin and Taxol on the cell line, due to an additive effect. For these reasons, HIF-1 α ODN has potential antitumor selective activity, decreasing cell proliferation, inducing apoptosis, and optimizing, in a synergistic manner, the efficacy of wide spectrum chemotherapeutic compounds when it used in a combined treatment.

Frequency of 14 genetic variants associated with breast cancer risk and treatment in a Colombian population / Frecuencia de 14 variantes genéticas asociadas con el riesgo y el tratamiento del cáncer de mama en una población colombiana

SUMMARY Introduction: Genetic variations have been related to risk and treatment efficacy. Many polymorphisms in breast cancer are known to influence susceptibility, breast cancer risk and treatment outcome. Polymorphisms vary among populations; therefore, local studies are necessary. Objective: To establish the frequency of polymorphisms associated to breast cancer risk and treatment pharmacogenomics in a group of Colombian individuals. Methods: Data from microarray profiles including gene polymorphisms associated with breast cancer treatment were retrospectively collected (Pathway Genomics®). The frequency of marker CYP2D6 rs3892097 and a breast cancer panel (CAS8 rs1045485, CHEK21100delC, ESR1 rs2046210, FGFR2 rs1219648, intergenic_2q35rs13387042, intergenic_8q24 rs13281615, MSRP30 rs10941679, TNRC9 rs3803662, AKAP9 rs6964587, LSP1 rs3817198, MAP3K1rs889312, PALBS1592 delT, ESR1 rs3020314) were studied. Results: Microarray data from 68 men and 92 women were analyzed. All polymorphisms were in Hardy-Weinberg equilibrium. Genotypic frequencies of CYP2D6 rs3892097 C/T, CAS8 rs1045485 G/C, and those of genes included in a breast cancer panel (CAS8 rs1045485, CHEK21100delC, FGFR2rs1219648, intergenic_2q35rs13387042, intergenic_8q24 rs13281615, MSRP30 rs10941679, TNRC9 rs3803662, LSP1 rs3817198, MAP3K1rs889312, PALBS1592 del T, ESR1rs3020314) did not significantly differ from previously published data. ESR1 rs2046210, with allele frequencies of C=0.04 and T=0.02, and AKAP9 rs6964587, with a frequency of A=0.005, were determined as rare. Conclusions: The population studied was not significantly different in allele distribution from previously reported data at HapMap. Genotypes in Colombian population are similar to other previously studied groups of healthy subjects. Extended use of genotyping pharmacogenetic polymorphisms will prevent toxicity and adverse effects in tamoxifen treatment (for example in CYP2D6 rs3892097). Therefore, therapeutic alternatives should be evaluated based on individual pharmacogenetic studies.

RESUMEN Introducción: las variaciones genéticas se han relacionado con el riesgo y la eicacia del tratamiento. Es sabido que muchos polimorfismos en cáncer de mama influyen en la susceptibilidad, el riesgo de cáncer y el resultado del tratamiento. Los polimorfismos varían entre las poblaciones, y por tanto, es necesario realizar estudios locales. Objetivo: establecer la frecuencia de polimorismos asociados al riesgo de cáncer de mama y la farmacogenómica del tratamiento en un grupo de individuos colombianos. Métodos: los datos de los perfiles de microarreglos, incluidos los polimorismos genéticos asociados con el tratamiento del cáncer de mama, se obtuvieron de forma retrospectiva (Pathway Genomics®). Se estudiaron la frecuencia del marcador CYP2D6 rs3892097 y un panel de cáncer de mama (CAS8 rs1045485, CHEK21100delC, ESR1 rs2046210,FGFR2 rs1219648, intergenic_2q35rs13387042, intergenic_8q24 rs13281615, MSRP30 rs10941679, TNRC9 rs3803662, AKAP9 rs6964587, LSP1 rs3817198, MAP3K1rs889312, PALBS1592 delT, ESR1 rs3020314). Resultados: se analizaron los datos de microarreglos de 68 hombres y 92 mujeres. Todos los polimorfismos siguieron el equilibrio Hardy-Weinberg. Las frecuencias fenotípicas de CYP2D6 rs3892097 C/T, CAS8 rs1045485 G/C, y aquellas de los genes incluidos en un panel de cáncer de mama (CAS8 rs1045485, CHEK21100delC, FGFR2rs1219648, intergenic_2q35rs13387042, intergenic_8q24 rs13281615, MSRP30 rs10941679, TNRC9 rs3803662, LSP1 rs3817198, MAP3K1rs889312, PALBS1592 del T, ESR1rs3020314) no difirieron significativamente de los datos publicados previamente. ESR1 rs2046210, con frecuencias alélicas de C = 0,04 y T = 0,02, y AKAP9 rs6964587, con una frecuencia de A = 0,005, se determinaron como raras.

Prevalencia de artritis reumatoide en Colombia: una aproximación basada en la carga de laenfermedad durante el ano˜ 2005 / Rheumatoid arthritis prevalence in Colombia: An approach based on burden of disease study during 2005

(AU) IntroducciónEn Colombia, a la fecha, se desconoce la prevalencia de artritis reumatoide (AR). El propósito de este estudio fue hacer una aproximación a la prevalencia de la AR en Colombia con respecto a bases documentales.Materiales y métodosMediante una revisión de bases administrativas, se identificaron los casos prevalentes de AR, notificados por el estudio Carga de Enfermedad Colombia 2005, de los Registros Individuales de Prestación de Servicios de Salud, correspondientes a la clasificación internacional de enfermedades, décima revisión, M05 y M06; dividiendo los casos prevalentes por las bases de población reportadas por el Departamento Nacional de Estadística en Colombia para el mismo año, se estimaron las prevalencias específicas por edad y sexo.ResultadosSe encontraron 267.628 casos prevalentes en el año 2005 en Colombia, la prevalencia global de AR correspondió a 0,9/100 habitantes, la razón mujer/hombre de AR fue 4:1, se apreció un incremento progresivo con la edad (pico en el grupo de mayores de 80 años).ConclusiónEste es el primer estudio de prevalencia de AR en Colombia con base en registros administrativos, la prevalencia por esta metodología fue similar a la encontrada por otros estudios en poblaciones de Europa y Sudamérica

Percepción de calidad de vida antes y después de la cirugía de revascularización miocárdica / Quality of life perception before and after coronary artery bypass grafting

Introducción: si bien son conocidos los beneficios de la cirugía de revascularización miocárdica en cuanto al alivio de los síntomas de los pacientes con cardiopatía isquémica, existen escasas publicaciones acerca de cómo perciben los pacientes su calidad de vida antes y después de esta intervención. El objetivo del presente trabajo es determinar la percepción de la calidad de vida de los pacientes antes y luego de un año de la cirugía de revascularización miocárdica. Material y método: en el período comprendido entre el 1º de agosto de 2012 y el 21 de agosto de 2013 se reclutó una cohorte prospectiva, observacional, de 202 pacientes de entre 35 y 70 años, hombres 158 (78,2%), sometidos a cirugía de revascularización miocárdica de coordinación y elección. Previo consentimiento informado se autoadministraron en el preoperatorio y al año de la intervención dos cuestionarios: (a) SF-36, que estima los componentes de salud física y mental a través de un score de 0 a 100 puntos en 36 ítems de ocho dominios: limitaciones por salud física, funcionamiento físico, dolor corporal, salud general, salud mental, funcionamiento social, limitaciones por estado emocional y vitalidad. La respuesta a cada ítem corresponde a escalas Likert o respuestas Sí/No. Para cada dimensión se determinó la fiabilidad de la respuesta a través de a de Cronbach (> 0,75). (b) DASI de 12 ítems que estima la capacidad física funcional de los pacientes cuya valoración máxima es 12 puntos (considerándose DASI bajo < 10 puntos). Resultados: ambos cuestionarios fueron completados por 199 pacientes, pues tres fallecieron en el período. (a) SF-36. Score medio antes versus un año después de la cirugía de revascularización miocárdica según los componentes: salud física 51 vs 84 (p=0,000); salud mental 51 vs 57 (p=0,07). En todas las dimensiones de salud física aumentaron significativamente los scores (p=0,000): limitaciones por salud física: 37 vs 86, funcionamiento físico: 55 vs 88, dolor corporal: 57 vs 86, salud general: 52 vs 75; en tanto en aquellas de salud mental el incremento significativo se produjo en limitaciones por estado emocional: 50 vs 79, y en funcionamiento social: 63 vs 86. Se observó una disminución significativa en salud mental: 49 vs 47 y no hubo cambios en vitalidad: 48 vs 47 (p=0,954). El ítem cambio en salud mostró un incremento significativo: 33 vs 88 (p=0,000). (b) La media de puntos DASI antes de la cirugía de revascularización miocárdica fue 8,01 ± 2,88, al año 9,27±2,27 (p=0,000). DASI <10 antes de la cirugía de revascularización miocárdica 61,8%, al año 39,2% (p=0,00000). Conclusión: la percepción de calidad de vida al año de la cirugía de revascularización miocárdica cambia significativamente en la dimensión de salud física y en la capacidad física funcional, no así en la percepción de la dimensión de salud mental, especialmente en vitalidad.

Introduction: the benefits in relieving symptoms in patients with ischemic heart disease after coronary artery bypass grafting are known but there is little information about how patients perceive their quality of life before and after this intervention. The aim of the study is to determine patients quality of life perception before and after a year of coronary artery bypass grafting. Methods: observational prospective cohort of 202 patients to coordination and election coronary artery bypass grafting procedure was enrolled between 1/8/2012 to 21/08/2013, their ages was between 35 and 70 years, were men 158 (78.2%). Preoperatively and one year after the intervention were self administered prior informed consent two questionnaires: (a) SF-36 which estimates physical and mental health components through a score from 0 to 100 points in 36 items and 8 domains: physical health limitations, physical functioning, bodily pain, general health, mental health, social functioning, emotional limitations and vitality. Item response scales yes / no and Likert. Reliability of the response was determined using Cronbach’s a (> 0.75). (b) DASI of 12 items that estimates the physical functional capacity of patients whose maximum score is 12 points (DASI considered low <10 points). Results: both questionnaires were completed by 199 patients as 3 died in the period. (a) SF-36. Mean score before vs. one year after coronary artery bypass grafting according to the components: Physical Health 51 vs. 84 (p = 0,000), Mental Health 51 vs. 57 (p = 0,07). In all dimensions to Physical Health the scores significantly increased (p = 0,000): physical health limitations: 37 vs. 86, physical functioning: 55 vs. 88, bodily pain: 57 vs. 86, general health: 52 vs. 75; while those of Mental Health the significant increase was in emotional state limitations: 50 vs. 79, and social functioning: 63 vs. 86. Was observed a significant decrease in mental health: 48 vs. 47 and no changes in vitality: 48 vs. 47 (p = 0,954). The item change in health showed a significant increase: 33 vs. 88 (p = 0,000). (b) The mean DASI points before coronary artery bypass grafting was 8,01 ± 2,88, after a year 9,27 ± 2,27 (p = 0,000). DASI <10 before CABG 61,8%, after a year 39,2% (p = 0,00000). Conclusion: the quality of life perception changes significantly in physical health dimension and functional physical capacity after one year to the coronary artery bypass grafting, not in the perception of mental health dimension, especially in vitality.

Dinámica del ciclo del nitrógeno y fósforo en suelos / Nitrogen and phosphorus cycles dynamics in Soils

Los ciclos biogeoquímicos del fósforo (P) y del nitrógeno (N) son sistemas dinámicos que suceden a través de la biosfera, de cuyos mecanismos de transformación depende la disponibilidad de estos elementos para diferentes formas de vida. Se acepta que la diversidad y actividad de las poblaciones microbianas posee un papel crucial en la dinámica de los nutrientes y por tanto el desafío está en comprender, como responden a las condiciones ambientales. La actividad microbiana en los suelos depende tanto de la condición del recurso y como de sus propiedades químicas, físicas y biológicas. En este documento se describen conceptos que se han empleado para entender la dinámica del nitrógeno y el fósforo, con el propósito de discutir cómo las características de las diferentes fracciones orgánicas y minerales seleccionan el potencial biológico encargado del recambio de dichos elementos, panorama que actualmente se aborda a través de técnicas independientes del cultivo para estudiar las poblaciones microbianas in situ.

Biogeochemical cycle’s phosphorus (P) and nitrogen (N) are dynamic systems taking place through the biosphere, whose mechanisms of transformation depends on the availability of these elements for different forms of life. It is accepted that the diversity and activity of microbial populations plays a crucial role in nutrient dynamics and therefore the challenge is to understand how they respond to environmental conditions. Microbial activity in soils depends on both the resource condition and its chemical, physical and biological properties. Concepts described herein have been used to understand the nitrogen and phosphorus dynamics, with the aim to discuss how the characteristics of the different organic and mineral fractions select the biological potential responsible for the turnover of these elements, scenario currently addressed through cultivation-independent techniques to study microbial populations in situ.

Development and validation of a TaqMan multiplex PCR assay for the Gene Dosage Quantification in cancer / Desarrollo y validación de PCR múltiplex con sondas TaqMan para la cuantificación de la dosis génica en cáncer

Gene dosage tests are very important for the molecular diagnosis of diseases caused by either deletion or amplification of a specific DNA region containing certain genes. Changes in gene copy number may lead to under- or over expression of genes responsible for the disease phenotype. Discovering these defects and understanding their biological meaning can lead to improved therapeutic opportunities in cancer. Fluorescent in situ hybridization (FISH) still remains the gold standard method for gene dosage analysis. However have several limitations since locus specific probes are expensive, the procedure is significantly time-consuming and tandem microduplications may be undetected as a result of the limited resolution on metaphase spreads. Quantitative Real-time PCR is a rapid assay with results available in 24h, has advantages in terms of sensitivity and specificity. In the present study, we have developed an assay using TaqManTM multiplex Real-time PCR for gene dosage analysis of oncogenes EGFR, ERBB2, AKT2, CMYC, MYCN, MYCL1, PI3KCA and REL in human cell lines. This method calculates the copy number of each oncogen and is a promising alternative technique to FISH and Southern blot. Therefore, this technique could be considered as a powerful method gene dosage quantitation in clinical and research genetic surveys.

La evaluación de la dosis génica constituye una herramienta importante para el diagnóstico molecular de enfermedades causadas tanto por la pérdida o amplificación de una región específica de ADN. El cambio en el número de copias génicas, puede conllevar a la pérdida o sobreexpresión de los genes responsables de fenotipo de la enfermedad. El descubrimiento de estas alteraciones y la comprensión de su significado biológico pueden conducir al incremento de las oportunidades terapéuticas en cáncer. La hibridación fluorescente in situ (FISH) es el método de referencia para el análisis de la dosis génica “amplificación”. Sin embargo, presenta algunas limitaciones relacionadas con el costo de las sondas locus específicas; el procedimiento es demorado y las microduplicaciones en tándem podrían no ser detectadas como resultado de la limitada resolución de las metafases. En este sentido, la PCR cuantitativa es una metodología rápida y tiene ventajas en términos de sensibilidad y especificidad. En el presente estudio, se estandarizó la PCR multiplex en tiempo real para el análisis de la dosis génica de los oncogenes EGFR, ErbB2, AKT2, cMYC, MYCN, MYCL1, PI3KCA y REL en líneas celulares tumorales humanas, como una técnica alternativa al FISH para evaluar la dosis génica en muestras clínicas de cáncer.

Detection of seven viruses and Mycoplasma in fetal bovine serum by real time PCR / Detección de siete virus y de Mycoplasma en suero fetal bovino por PCR en tiempo real / Detecção de sete vírus e de Mycoplasma em soro fetal bovino por PCR em tempo real

Objective: real time PCR analysis for the detection of seven bovine pathogenic viruses: Bovine Adenovirus (BAdV), Bovine Viral Diarrhea Virus Types 1 and 2 (BVDV-1 and BVDV-2), Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV), Vesicular Stomatitis Virus (VSV), Bovine Parainfluenza Virus 3 (BPIV-3), Bovine Herpes Virus-1 (BoHV-1), and Mycoplasma was conducted using fetal bovine serum (FBS, MICROGEN®) obtained in Colombia, aiming to include it as part of the serum quality control. Methods: bovine derived MDBK and human derived HEp-2 cell lines were cultured with the test serum for 21 days, collecting supernatant and cellular samples every 7-days. Once DNA and RNA were extracted, the later was converted into cDNA and both samples were subjected to real time PCR using specific primers and Resolight® (DNA-binding fluorescent dye). Standard curves were generated using serial dilutions of cloned specific viral sequences. Accurate amplification and high efficiency was demonstrated in these reactions. Results: realtime PCR amplification did not show a persistent increase of viral counts in cultures during the 21-day follow-up. However, for vesicular stomatitis virus, a transient increase was observed at 7 and 14 days in both cell lines, but considered as not conclusive for viral presence. Conclusions: real time PCR analysis showed to be a suitable method for viral detection in fetal bovine serum samples and through this method no consistent viral or mycoplasma presence was detected in the MICROGEN® fetal bovine serum.

Objetivos: se empleó el método de PCR en tiempo real para detectar los virus patógenos bovinos: Adenovirus bovino (BAdV), virus de la diarrea Viral Bovina tipos 1 y 2 (BVDV-1 y BVDV-2), Virus Respiratorio Sincitial Bovino (BRSV), Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV), Virus de la Parainfluenza Bovina tipo 3 (BPIV-3), Herpesvirus Bovino-1 (BoHV-1) y Mycoplasma, en suero fetal bovino (FBS, MICROGEN ®)obtenido en Colombia, con el objetivo de incluir estos análisis en el control de calidad del FBS. Metodos: las líneas celulares MDBK de origen bovino y HEp-2 de origen humano se cultivaron con el FBS MICROGEN® por 21 días, tomando muestras de cultivos y sobrenadantes cada 7 días. Una ves extraido el DNA y RNA, a partir de este último se sintetizó cDNA, y en los dos tipos de muestras se analizó la presencia de los agentes patógenos mencionados por PCR en tiempo real empleando iniciadores específicos para cada uno y Resolight® (colorante fluorescente de unión a DNA). Se generaron curvas estándar con diluciones seriadas de secuencias virales específicas clonadas en plásmidos, que mostraron amplificación específica y altas eficiencias. Resultados: el análisis de los cultivos mantenidos con el FBS en estudio no mostró aumento del número de copias virales detectadas a lo largo del periodo de 21 días de seguimiento, excepto para el virus de la estomatitis vesicular, que mostró un incremento transitorio en los sobrenadantes de los cultivos de las dos líneas celulares a los 7 y 14 días de cultivo, que no se consideró concluyente para la presencia del virus. Conclusiones: el método de PCR en tiempo real mostró utilidad para la detección de virus patógenos y mycoplasma en FBS, y mediante este método no se obtuvieron resultados que permitan concluir que los patógenos virales o los mycoplasmas están presentes en los cultivos mantenidos con el suero fetal bovino MICROGEN®.

Objetivo: Foi utilizado o método de PCR em tempo real para detectar os vírus patogénicos bovinos: Adenovírus Bovino (BAdV), Vírus da Diarreia Viral (BVDV-1 e BVDV-2), Vírus Respiratório Sincicial Bovino (BRSV ), Vírus da Estomatite Vesicular (VSV), Vírus da Parainfluenza Bovina tipo 3 (BPIV- 3), Herpesvírus Bovino-1 (BoHV-1) e Mycoplasma, em soro fetal bovino (FBS, Microgen®) obtido na Colômbia, de modo a incluir esta análise no controle de qualidade FBS. Métodos: as linhas celulares de MDBK de origem bovina e HEp-2 de origem humana foram cultivadas com FBS Microgen® durante 21 dias, tomando amostras de cultura e sobrenadantes cada 7 dias. Uma vez retirado o DNA e RNA, foi sintetizado o cDNA a partir do RNA. Nos dois tipos de amostras foram analisadas para determinar a presença de patógenos mencionados por PCR em tempo real usando primers específicos para cada um e Resolight®(corante fluorescente de união à DNA). As curvas padrão foram geradas com diluições em série de sequências virais específicas, clonadas em Resultados: plasmídeos, que mostram amplificação específica e altas eficiências. a análise das culturas mantidas em FBS em estudo, não mostraram aumento no número de cópias virais detectadas ao longo do período de 21 dias de seguimento, exceto para o vírus da estomatite vesicular, que mostrou um aumento transitório nos sobrenadantes das culturas de duas linhas celulares aos 7 e 14 dias de cultura, que não foi considerado conclusivo para a presença do vírus. Conclusões: O método de PCR em tempo real foi útil para a detecção de vírus patogênicos e mycoplasma em FBS, e por este método foram obtidos resultados que demonstram que patógenos virais ou mycoplasmas estão presentes nas culturas mantidas com soro fetal bovino Microgen®.

Comparación de cuatro métodos de restauración del ADN en muestras de plasma y láminas de citología cérvico-uterina como una herramienta para mejorar la calidad de la muestra / Comparison of four methods of DNA restoration in samples from plasma and pap smears as a tool for better the samples

Objetivos: comparar cuatro métodos de restauración del ADN en plasma y láminas cérvico-uterinas como una herramienta para mejorar la calidad de la muestra. Métodos: a 20 muestras de plasma sanguíneo y 20 muestras de láminas citológicas, se les realizó aislamiento de ADN mediante kit comercial y fenol-cloroformo. A todas las muestras se les realizó un tratamiento pre-PCR con cuatro diferentes tipos de actividad de ADN polimerasa: 1. Exonucleasa y endonucleasa 5'-3'. 2. Exonucleasa 5'-3'. 3. Klenow, y 4. Klenow más ligasa. Los diferentes métodos se evaluaron mediante PCR en tiempo real con el gen ALU. Resultados: todos los métodos de restauración mejoran la calidad del ADN en los dos tipos de muestras. El método 3 mostró mejores resultados en plasma y en lámina, incrementando la concentración del ADN de 0,0022 ng/µL a 0,6474 ng/µL en láminas de citología y de 0,0039 ng/µL a 0,435 ng/µL en plasma sanguíneo. Conclusiones: ADN de las muestras de plasma y lámina al ser tratadas con un proceso de restauración aumenta la calidad del ADN en comparación a las muestras no tratadas.

Objetives: To compare four methods of restoration of DNA in plasma and PAP smears as a tool to improve the quality of the samples. Methods: 20 blood samples and 20 PAP smears samples, we performed DNA isolation by commercial kit and phenol-chloroform respectively. Then all samples underwent a pre-PCR treatment with four different types of activity DNA polymerase: 1. Exonuclease and endonuclease 5'-3'. 2. Exonuclease 5'-3'. 3. Klenow, and 4. Klenow more ligase. Different restoration methods were evaluated quantitatively by real-time PCR with gene ALU. Results: All restoration methods improve the quality of DNA in both types of samples. However, the 3th method showed better results in both plasma and PAP smears, increasing the concentration of DNA from 0.0022 ng/mL to 0.6474 ng/mL in PAP smears and 0.0039 ng/mL to 0.435 ng/mL in blood plasma. Conclusions: DNA from plasma samples and PAP smears to be treated with a restoration process increases the quality of DNA compared to untreated samples.

Genotipificación del virus de papiloma humano en mujeres con hallazgo citológico de lesión escamosa intraepitelial de bajo grado (lsil) o de significado indeterminado (asc-us) en Bogotá, Colombia / Genotiping human papillomavirus in patients with low-grade squamous intraepithelial lesion or atipycal squamous cells of uncertain significance (asc-us) in Bogotá, Colombia

El virus de papiloma humano (vph) es el principal factor de riesgo asociado al cáncer cervical, y es la causa de muerte más común por cáncer entre las mujeres en Colombia. Por tanto, crece el interés a nivel mundial y nacional por mejorar las estrategias de control y diagnóstico de la infección; incluyendo técnicas de diagnóstico molecular que identifiquen y diferencien tipos virales específicos para así tener mejor entendimiento de la dinámica del virus en la historia natural de la infección por vph. En el presente trabajo se detectó el vph en 363 pacientes diagnosticadas con lesiones asc-us o lsil en su citología, pertenecientes al programa de tamizaje de cáncer de cérvix de la eps Sanitas. Sólo a 302 de estas muestras se les pudo realizar genotipificación por Reverse Line Blot, de éstas el 20,5% (62/302 pacientes) fueron positivas para vph; los tipos virales de alto riesgo estuvieron presentes en el 82,2% y los de bajo riesgo, en el 17,8%. Por primera vez se realiza un acercamiento a la descripción de tipos virales específicos, encontrados en muestras con diagnóstico citológico de asc-us o lsil en Bogotá.

Human papillomavirus (hpv) is the principal risk factor associated with cervical cancer, the most common malignancy among women in Colombia. Therefore, a growing concern globally and nationally to improve strategies to control and diagnosis of infection, including molecular diagnostic techniques to identify and differentiate specific hpv types thus have a better understanding of the dynamics of the virus in history natural infection. In the present work was performed hpv detection and genotyping in 302 of 363 patients who normally attended the screening program of the eps Sanitas, and were subsequently diagnosed with asc-us lesions. We found hpv in 20.5% (62/302 patients) divided into 82.2% for high-risk viral types and 17.8% for low risk. For the first time was a description of specific viral types found in samples of asc-us in Bogotá.

Influencia del tratamiento de Petiveria alliacea en la expresión diferencial de genes en células tumorales / Differential gene expression in tumor cells induced by Petiveria alliacea treatment

El estudio del perfil de expresión génica en las células eucariotas se constituye como una herramienta importante en el entendimiento de las huellas moleculares generadas en respuesta a un estímulo farmacológico. A partir de Petiveria alliacea, una de las plantas colombianas con actividad antitumoral, se ha obtenido la fracción FAST 8 7:3, en la cual se han encontrado diferentes compuestos, como el trisulfuro de dibencilo, uno de los componentes antitumorales más potentes reportados para la planta. Esta fracción también posee actividad citotóxica sobre la línea de células tumorales K562 e induce cambios en el perfil de expresión de genes, que podrían estar relacionados de alguna forma con la actividad antitumoral tradicional reportada para esta planta. Esta actividad puede ser ejercida, en parte, por la presencia del trisulfuro de dibencilo y por la actividad de los otros componentes de la fracción. En este contexto, proponemos el uso del ADNc-AFLP como herramienta útil en la tamización del perfil de genes transcritos en las células tumorales y, también, como herramienta útil para el descubrimiento de nuevos fármacos antitumorales...

Abstract Gene expression profile in eukaryotic cells is a very useful tool to understand the molecular footprint responsible for the pharmacological response to a stimulus. In the present study a fraction named FAST 8 (7:3), obtained from Petiveria alliacea, was used as stimulus to track out the gene expression profile on K562 cell line. P. alliacea is a plant that grows in Colombia, and in traditional medicine is used for its anti-tumoral activity. Of the different compounds present in the fraction, dibenzyl trisulfide (DTS), is a compound described by previous reports to have anti-tumoral properties. The fraction exhibits cytotoxic activity over tumor cell line K562 inducing changes in gene expression profile. DTS might be in part responsible for the fraction activity, but the other compounds may also contribute to the biological response. Herein, we propose the use of cDNAAFLP as a useful tool for gene expression profile screening of tumoral cells and in the discovery of new anti-tumoral drugs...

Desproporción prótesis-paciente en la cirugía de sustitución valvular aórtica y mortalidad quirúrgica / Disproportion prosthesis-patient surgery for aortic valve replacement and surgical mortality

La incidencia de desproporción prótesis-paciente (DPP), expresada como área del orificio efectivo indexada (AOEI), varía entre 19%-70% y su efecto sobre la morbimortalidad es controvertido. Esto es de interés debido a la frecuencia del procedimiento. Objetivo: determinar la incidencia acumulada de DPP y mortalidad quirúrgica en pacientes elegidos para cirugía de sustitución valvular aórtica (CSVA). Material y método: entre enero de 2004 y junio de 2007 se realizaron 131 CSVA en portadores de estenosis aórtica. Caso incidente de DPP: si AOEI < 0,85 cm2/m2; moderada, entre 0,85- 0,65 y severa < 0,65. En 13 (9,9%) no fue posible determinar el área del orificio efectivo (AOE). La mortalidad quirúrgica se considera según la Society of Thoracic Surgeons (EE.UU.). Las incidencias acumuladas (IC95%) se calcularon estratificadas por severidad de la DPP. La asociación DPP - mortalidad quirúrgica se exploró por probabilidad exacta. Resultado: la incidencia acumulada de DPP fue 41/118 (34,7%, IC95%: 26%-44%), moderada en 26/118 pacientes (22,0%, IC95%: 15%-31%) y severa en 15/118 (12,7%, IC95%: 7%-20%). En todos, la mortalidad quirúrgica fue 10/131 (7,6%, IC95%: 4%-14%), y en los que se estimó DPP fue 9/118 (7,6%, IC95%: 4%-14%). En los pacientes sin DPP fue 6/77 (7,8%, IC95%: 3%-17%) similar a los con DPP que fue 3/41 (7,3%, IC95%: 2%-20%), p=1. En la DPP moderada la mortalidad quirúrgica fue 1/26 (3,8% IC95%: 1%-19%) y en DPP severa 2/15 (13%, IC95%: 2%-40%). Conclusión: más del 30% de los pacientes con CSVA tuvieron DPP, siendo severa en 13%. No se encontró asociación entre DPP y mortalidad quirúrgica.

The incidence of prosthesis-patient mismatch (PPM) expressed as the indexed effective orifice area (IEOA) varies between 19%-70% and its effect on morbidity and mortality is controversial. This is of interest because the frequency of the procedure.Objective: determine cumulative incidence of PPM and surgical mortality in patients selected for aortic valve replacement surgery (AVRS). Material and method: between January 2004 and June 2007, 131 surgeries for aortic stenosis were done. PPM incident case if AOEI <0,85 cm2/m2; moderate between 0,85-0,65 and severe <0,65. In 13 (9,9%) was not possible to determine EOA. Surgical mortality is considered as the Society of Thoracic Surgeons, USA. The cumulative incidence (95% CI) were calculated stratified by severity of the PPM. The association PPM - surgical mortality was explored by exact test. Results: The cumulative incidence of PPM was 41/118 (34,7%, 95% CI: 26%-44%), moderate in 26/118 patients (22,0%, 95% CI: 15%-31%) and severe in 15/118 (12,7 %, 95% CI: 7%-20%). In all the surgical mortality was 10/131 (7,6%, 95% CI: 4%-14%), and the PPM was estimated to be 9 / 118 (7,6%, 95% CI: 4%-14%). In patients without PPM was 6 / 77 (7,8%, 95% CI: 3%-17%) similar to the PPM which was 3 / 41 (7,3%, 95% CI: 2%-20%), p=1. In the PPM moderate surgical mortality was 1/26 (3,8%, 95% CI: 1%-19%) and severe PPM 2/15 (13%, 95% CI: 2%-40%). Conclusion: more than 30% of patients with AVRS had PPM, being severe in 13%. No association was found between PPM and surgical mortality.

DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS PARA EL ESTUDIO DE GENES CELULOLÍTICOS Y SOLVENTOGÉNICOS EN CEPAS COLOMBIANAS DE Clostridiumsp. (CLOSTRIDIACEAE) / Oligonucleotide Probe Design for the Study of Cellulolytic and Solventogenic Genes in Colombian Clostridiumsp. strains (Clostridiaceae)

El objetivo de este estudio fue analizar las rutas metabólicas para la producción de solventes y degradación de celulosa en cepas colombianas promisorias del género Clostridium. Para ello se diseñaron sondas de hibridación que sirvieran para posteriores estudios de mejoramiento genético de las cepas. Se construyó la base de datos denominada MULTICLOST en Microsoft Access® con las secuencias de 485 genes involucrados en las rutas metabólicas arriba mencionadas, provenientes de 45 especies bacterianas y 10 especies fúngicas. Los genes fueron agrupados de acuerdo al tipo de enzima y a los dominios catalíticos o de unión a sustrato en el caso de las celulasas. Cada grupo se sometió a alineamiento múltiple en ClustalW 1.83 y con base en los resultados se crearon subgrupos de similitud mayor al 50%. Se localizaron secuencias conservadas de longitud mayor a 19 nucleótidos en GeneDoc 2.6.002 y sus valores termodinámicos fueron estimados con GeneRunner v3.05, mientras que la sensibilidad y especificidad fue verificada por búsquedas en GenBank usando BLASTN 2.2.8. En total se obtuvieron 94 secuencias conservadas con las siguientes características: longitud promedio de 24 nucleótidos, Tm promedio de 65,8 ºC y contenido de (G+C) entre 14,3 y 60,0%. Se determinó que ninguna de las sondas diseñadas forma estructuras secundarias estables con Tm superior a 36,1 ºC. De acuerdo a sus características y valores termodinámicos, todas las sondas podrían ser utilizadas en la construcción de un microarreglo o en reacciones de PCR para la identificación de regiones relevantes en el mejoramiento del proceso por ingeniería metabólica.

The goal of the present study was to analyze the metabolic pathways involved in solvent production and cellulose consumption by promising Colombian native strains of the genus Clostridium. Therefore a set of oligonucleotide probes was designed, with the aim of analyzing potential targets for genetic improvement of the Colombian strains. The database named MULTICLOST was created in Microsoft Access® using the sequences from 485 genes involved in solventogenesis, 1,3propanodiol production and cellulolysis from 45 bacterial and 10 fungal species. The genes were grouped according to their respective enzyme function and to the catalytic domain or the substrate binding domain in the case of cellulases. ClustalW 1.83 was used for multiple alignment of every group. Subgroups of sequences with more than 50% identity among themselves were created. Conserved sequences longer than 19 nucleotides were identified using GeneDoc 2.6.002 and their thermodynamic values were calculated with GeneRunner v3.05, while their sensitivity and specificity were verified by searching in GenBank with BLASTN 2.2.8. Ninetyfour conserved sequences were obtained with an average 24nucleotide length, 65.8ºC average Tm and a (G+C) content between 14.3% and 60.0%. None of these probes forms stable secondary structures at temperatures higher than 36.1ºC. According to the former results, all of the probes could be used in an oligonucleotide microarray or in PCR reactions for the identification of metabolic targets for improvement of the industrial process.

Genome analysis of thirteen Colombian clostridial strains by pulsed field gel electrophoresis

Pulsed field gel electrophoresis was used for estimating the size of the genome and evaluating the presence of megaplasmids in 13 native Colombian solventogenic Clostridium strains. DNA preparation and purification were optimised for obtaining differentiated restriction fragments in electrophoresis. Genomic DNA was digested with ApaI, Eco52I, SmaI and XhoI enzymes. Estimated genome size for native strains ranged from 4.0 to 4.2 mega base pairs. Larger sized plasmids were detected and the presence of genes related to megaplasmid pSOL1 was determined by polymerase chain reaction. adc gene region amplification suggested that genes related to solventogenesis in native strains may be located in an extra-chromosomal element. Determining genome size provides useful information aimed at enhancing native strains' solvent production.

Implementación de un método fluorométrico para evaluación de actividad anti transcriptasa reversa del virus VIH-1 / Implementation of a fluorometric method for the anti HIV-1 virus reverse transcriptase activity evaluation

Se implementó una prueba de tamizaje preliminar para evaluar la potencial inhibición ejercida por productos de origen natural y sintético sobre la actividad de la proteína Transcriptasa Reversa del virus VIH-1, en respuesta a la necesidad de disponer de un ensayo in vitro no radioactivo, relativamente rápido, que arroje resultados válidos, con costos moderados, bioseguro y de fácil acceso. Esta prueba se basa en la capacidad que tiene la proteína transcriptasa reversa viral para formar DNA de cadena sencilla (cDNA) a partir de RNA, utilizando deoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs), proceso conocido como transcripción reversa. Para detectar la actividad de la proteína se realizaron ensayos fluorométricos in vitro, usando proteína recombinante sin purificar, y nucleótidos fluorescentemente marcados (Cy3-dCTP) como parte del sustrato. Las condiciones establecidas para la actividad de la proteína fueron 5µg/reacción de RNA total y 2µg/reacción de oligo-dT12-18, reflejadas en 43.6 por ciento de incorporación del nucleótido fluoromarcado